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TP4 Techniques de biologie moléculaires

Ce TP est un gros pavé ! Nous allons l'alléger de tout ce qui n'est pas textuellement au programme, et nous allons le fragmenter pour le rendre plus digeste. Ces techniques doivent être maîtrisées pour affronter les épreuves B sur docs en génétique.

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SUPPRIMER DU POLY :    -la page 8 car nous ne ferons pas la partie proatique du TP

                                            -les pages 9 et 10 car le séquençage n'est pas textuellement au programme et que les technique exposées ici, si elles sont compréhensibles par les

                                                                                                                    étudiants ne sont plus utilisées en 2020 à l'heure du pyroséquençage à haut débit

Marie-Aude et moi, nous sommes calées pour réaliser exactement les mêmes séances (le même code couleurs, bref sympbiose parfaite ...)

Vous trouverez son diaporama commenté avec les exos de la séances, intégrés et commentés en fin de chaque journée (à côté de l'icône Ophrys).

Vous choisissez tout seul comment vous désirez travailler (avec son diapo dès le début ou en le prenant aux moments difficiles...)(

Laurent nous rejoindra quand il aura fini de scanner une à une les 385 pages de la flore Bonnier et mis les liens hypertexte dessus pour vous éviter de tourner les pages. Vous pouvez lui allumer une chandelle de remerciements.

Semaine du 23 mars : I et IV

   Lundi

23 mars

  2020

TP4 : uniquement le I (2h).

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page 1 : à quoi servent ces techniques d'étude du génome ?

*Surligner à 8h au Stabilo orange : Connaitre la structure et le fonctionnement des génomes (lire les sous-boites)

*Surligner à 17h au stabilo vert : Comprendre le fonctionnement des cellules et organismes

                                  -déduire le rôle d'un gène en le mettant KO (obs° : on coupe le fil, les phares s'éteignent => Int° :  le fil sert à allumer les phares)

                                   -déduire les aa essentiels d'une protéine par mutagénèse dirigée (substitution glu165 par ala165 ==> perte d'activité TPI)

                                  -Rechercher dans quelles cellules on trouve un ARNm (hybridation in situ) pour connaître le patron

                                     d'expression d'un gène dans l'espace (dans quelles cellules il s'exprime) et le temps (quand?)

*surligner à 12h au stabilo bleu : les applications biotechnonogiques découlant des connaissances de la génomique

                                   -étude de maladies génétiques (déterminer si un embryon est porteur de la mucoviscidose (diagnostic prénatal), tenter de réparer le gène

                                                                chez un individu (thérapie génique)

                                   -police scientifique (déterminer par empreintes génétique si un échantillon biologique (poil, sang, sperme...) correspond ou non à un suspect)

                                   -faire produire des protéines d'intêret (Insuline humaine produite par des bactéries pour les diabétes de type I).

                                   -"améliorer" génétiquement des plantes (OGM végétaux : Maïs Round up ready (aspergé de l'herbicide total roundup, il survit

                                                        alors que toutes les adventices meurent ce qui évite le désherbage); Golden rice (permettant l'accès à la vitamine A chez des populations humaines en carence)

I-Les endonucléases de restriction : ciseaux à ADN spécifiques

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A-Technique (p3)

-Comprendre pourquoi on rajoute "de restriction" au terme endonucléase

-Maîtriser les termes site de restriction, fragment de restriction, coupure franche ou cohésive

-Dessiner les  fragments de restrictions attendus après coupure, en indiquant les extrémités 3' et 5' à chaque fois (vérifier ci-dessous votre schéma).

-Visionner le ppt de Laurent géray (cliquer sur l'icone Coccolitho MEB)

enz de restr.jpg
Coccolitho Laurent.jpg

​A-Applications

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1-la RFLP (Polymorphisme de longueur des Fragments de Restriction)

​

-Compléter les ... : phosphate, longueur, 2nm, sa longueur.     BILAN... : taille, masse, encombrement, taille

-Finir de lire la page3 et savoir que  l'Ethidium rend l'ADN fluorescent dans le visible quand on l'éclaire aux UV

​

Compléments empreintes génétiques (culture générale) pages 4 et 4bis (donc à lire et comprendre mais pas apprendre)

 

-Lire page 4

-Comprendre grâce à mes deux dessins ci-dessous (cliquer dessus pour les aggrandir)

-Visionner le premier film qui résume les 2 dessins (les deux autres films sont facultatifs)

-Lire la page 4bis

epreintes_génétiques_RFLP.jpg
empreintes_génétiques_par_PCR.jpg

​2-Réalisation d'une carte de restriction

 

-Lire uniquement le 2 page 5 (on garde le 3 recombinaison et KO de gènes pour mardi)

-ne pas faire l'exo page 6 on le garde pour mardi

-Compléter la page 7 TP électrophorèse du phase lambda aspects théoriques (nous ne ferons pas la page 8 aspects pratiques) et vérifier vos réponses (bouton marron)

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-Garder la page 8bis comme TD à faire en autonomie pour la semaine prochaine (Carte de fragment de restriction donc  linéaire, correction en bas de page dans le poly).

-Faire pages suivantes les exercices 1 et 2 d'établissement de carte de restriction de plasmides circulaires  en utilisant la méthode Mathis Esclangon exposée dans le diaporama ci-dessous.

Méthode Mathis ESCLANGON :

1-Déterminer d’après l’intitulé si l’ADN est linéaire ou circulaire

 

2-Déterminer sa taille totale en additionnant les fragments

 

3-Dessiner au compas la carte de l’Enzyme E1 ayant le plus grand nombre de site de restriction. Positionner au stylo les 3 sites de restriction E1 sur le plasmide en inscrivant la taille des fragments E1 et en respectant les tailles des fragments sur le schéma.

4-Trouver les fragments de restriction issus d’une double digestion (donc obtenus uniquement en présence des deux enzymes E1 + E2), et retrouver, en les additionnant, quels fragments de double digestion correspondent aux fragments de restriction E1

(sommer les fragments de double digestion pour obtenir les simple digest : ex 5,5 = 2,5 + 3)

Localiser alors au crayon de papier les sites E2 à l’intérieur des fragments E1 avec les 2 hypothses possibles (l’une à l’extérieur du plasmide, l’autre à l’intérieur).

 

5-Valider l’une des deux hypothèses grâce aux taille des fragments de simple digestion pour E2.

Ophrys Marie.JPG

Pour retourner au chapitre 4 : la transcription et son controle, cliquer ici

   Mardi

24 mars

   2020

TP4 : fin du I (joue avec les extrémités cohésives) +IV- clonage de l'ADN (ADN génomique ou ADNc obtenus par RT-PCR) (1h30)

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+ Crispercas 9 = KO ET editing si on a le temps

TP4 : page 5 : retour aux endonucléases de restriction et zoom sur leurs extrémités cohésives permettant de rabouter deux fragments de restriction

​

Les schémas que j'ai refais en-dessous de ce paragraphe sont accessibles en version pdf en cliquant sur le crayon marron avant les schémas.

 

3-Fabrication d'extrémités cohésives utilisées pour RECOMBINER (="rabouter puis souder") deux molécules d'ADN, KO de gène par insertion d'une séquence d'ADN dans un gène

​

Une molécule d'ADN recombinante résulte de la RECOMBINAISON (= soudure) de deux molécules d'ADN d'origine différente (connaitre cette définition).

​

Par exemple, si on désire introduire un gène humain (le gène codant pour l'hormone de croissance humaine) dans une bactérie, on réalise une recombinaison d'ADN humain et bactérien.

Pour que le gène humain se réplique dans la bactérie et que chaque bactérie fille hérite d'un exemplaire de ce gène hUmain, il est nécessaire d'introduire ce gène dans un vecteur (=molécule d'ADN transportant le gène dans la bactérie et permettant sa multiplication (connaitre cette définition)).

Bien souvent, les vecteurs utilisés sont des plasmides bactériens; en effet, ilos possèdent naturellement une origine de réplication qui leur permet de se multiplier dans les bactéries. Ils ont aussi de nombreux gènes de résistance aux antibiotiques (comme le gène AmpR  qui confère une Résistance à l'Ampicilline (les noms de gènes sont par convention en italique pour ne pas les confondre avec les noms de PROTEINES en MAJUSCULES)).

Ces gènes de résistance serviront de gènes rapporteurs (Hermione Granger dans "Harry Potter à l'école des sorciers" ?? quoi qu'elle n'est pas si fayotte au final) en informant le chercheur de la réussite ou de l'échec des étapes de manipulation.

On peut modifier artificiellement ces vecteurs pour les doter d'autres gènes rapporteurs.

Dans certains vecteurs, par exemple, on rajoute au plasmide le gène béta-galactosidase (= gène lac Z ) codant pour une enzyme, la BETA-GALACTOSIDASE (voyez comme c'est pratique, on ne confond plus gène et PROTEINE) qui hydrolyse le lactose en glucose + galactose (mais ça on s'en fiche car on mettra du glucose et non du lactose dans le milieu de culture) et un analogue artificiel du lactose, le X-gal, en un produit bleu.

Une bactérie bleuesur milieu contenant du X-gal informe le chercheur que la bactérie possède le gène beta-gal, alors qu'une bactérie blanche signifie que la bactérie ne possède pas le gène béta-gal ou qu'il a été mis KO (on met KO un gène en insérant un autre gène dedans, ça coupe le gène en 2, l'ORF n'est plus fonctionnelle).

Le gène béta-gal qu'on rajoute contient en plus dans son ORF un site de restriction à une enzyme de restriction, nous verrons que c'est super pratique pour y insérer un gène et savoir qu'il a bien été inséré (Hermione Granger alias lac Z va lui dire !).

​

Il faut 2 étapes successives pour insérer un gène humain dans une bactérie :

1-ETAPE DE RECOMBINAISON  souder le gène humain et le plasmide bactérien (= mettre le gène de l'hormone de croissance dans le plasmide) ce qui nécessite :

           a-de préparer l'ADN à insérer et le plasmide avec la même enzyme de restriction (pour qu'ils aient les mêmes bouts collants)

           b-de les incuber ensemble avec un ligase (pour souder!), en espérant qu'elle intègre l'insert dans le plasmide

2-ETAPE DE TRANSFECTION des bactéries : faire rentrer les plasmides recombinants dans les bactéries (par transfert horizontal de gènes)

 

Il faut aussi s'assurer que les étapes 1 et 2 ont bien fonctionné grâce aux gènes rapporteurs (gènes béta-gal (=LacZ) et AmpR : les "Hermione Granger" du plasmide).

​

ADN recomb 1.jpg
ADN recomb 2.jpg

Page suivante faire le TD de Dany Marfaux (BCPST1 Reims)

TP4 : page 16 : Différence entre ADN génomique et un ADNc (= ADN complémentaire d'un ARNm = gène eucaryote sans introns).

​

Dans l'exemple précédent d'insertion du gène de l'hormone de croissance humaine dans une bactérie on a obtenu un clone de bactéries répliquant à chaque division cellulaire le gène de l'hormone de croissance humaine.

Ces clones de bactéries, qui clonent un fragment de notre génome représentent une partie d'une banque d'ADN génomique.

En réalité la totalité du gènome humain, se trouve, sous forme de fragments de restriction, dans des clones bactériens indépendants et référencés qui poussent dans des boites de Pétri. L'ensemble de ces clones constitue ce qu'on appelle une banque d'ADN génomique.

 

Cependant ces banques d'ADN génomique ne peuvent servir à fabriquer des protéines humaines (la bactérie ayant intégré le gène de l'hormone de croissance humaine ne peut fabriquer l'HORMONE DE CROISSANCE, car les gènes humains contiennent des introns que les bactéries ne savent pas enlever puisqu'elles n'ont aucune machinerie permettant l'épissage des ARNprém.

​

D'autres banques sont donc réalisées à partir d'ADN complémentaire qu'on note ADNc, obtenus par transcription inverse (= reverse transcription = rétro-transcription, bref c'est une transcription à l'envers : ARN => ADN) d'un ARNm et qui sont au final des gènes aucaryotes (car ADN) sans introns (car même séquence qu'ARNm mature). (vous devez savoir définir ce terme et comprendre comment on obtient des ADNc, c'est l'objet de la figure ci-dessous).

​

Le schéma que j'ai fais en dessous de ce paragraphe est bien mieux que celui qui est dans vos poly de la page 16, si vous avez la possibilité de le remplacer dans le poly en imprimant la page ci-dessous (ppt accessible grâce à l'icone crayon marron), coloriez-le au fur et à mesure, sinon redessinez-le !

​

1-Les ARNm matures (donc sans introns) sont purifiés par chromatographie d'affinité sur colonne de poly U : seuls restent adsorbés sur la colonne les ARNm matures qui, chez les eucaryotes se terminent toujours par une queue de poly A en 3' (notez que les protéines et ARNt ne restent pas fixés sur la colonne).

 

2-Ces ARNm sont rétro-transcrits en ADN mono (dans l'hétéroduplex dessiné le trait fin est vert (ARNm) et le trait épais est rouge (ADNc) puis double brin grâce à la transcriptase inverse : l'ADN double brin obtenu est nommé ADNc.

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3-Comme des ADNc très variables (correspondant à tous les ARNm cellulaires) sont présents, et qu'on ne désire insérer dans les bactéries que celui de l'hormone de croissance humaine (et non celui de la Triose Phosphate Isomérase à droite), on choisit des amorces correspondant au début et à la fin de l'ADNc d'interet (celui de l'hormone de croissance humaine et on amplifie par PCR uniquement cet ADNc Hormone de croissance.

L'ensemble des étapes 2 et 3 c'est -à-dire 1-"Reverse Transcription" + 2-PCR se nomme RT-PCR (technique à connaître). à l'issue de la RT-PCR seul l'ARNm d'interet (celui de l'Hormone de croissance humaine) a été amplifié sous forme d'ADNc (= gène hormone de croissance dépouvu d'Introns).

​

4-Il suffit d'intégrer cet ADNc dans un vecteur par recombinaison, puis de transfecter une bactérie du vecteur recombinant comme précédemment pour obtenir un clone bactérien recombinant qui possède l'ADNc du gène de l'hormone de croissance humaine, et qui, cette fois-ci, peut l'exprimer (par transcription + traduction) en HORMONE DE CROISSANCE HUMAINE.

​

Remarque : il est possible de soigner par injection d'hormone de croissance des enfants atteint de nanisme "harmonieux" dont la cause est un déficit de sécrétion d'hormone de croissance dans l'enfance.

Avant les technologies d'ADN recombinant, ces enfants étaient soignés par injection d'hormone de croissance purifiée (mal !) à partir d'hypophyses de cadavres humains... Les solutions injectées à ces enfants contenaient malheureusement la protéine Prion, de nombreux enfants sont décédés de la maladie de Creuzfeult Jabob : c'est le scandale de l'homone de croissance.

Attention, certaines formes de nanisme ("non harmonieux cad taille du tronc adulte mais taille des membres courtes) ne sont pas soignables par injection d'H de croissance car le pb ne vient pas de l'H mais de son récepteur par exemple).

Faire fabriquer des protéines d'interet par des clones bactériens génétiquement modifiés (bactéries OGM) est utilisé de nos jours de manière routinière : c'est ainsi qu'est fabriquée, par exemple, l'insuline que s'injectent plusieurs fois par jour les individus atteints de diabète de type I (= diabète insulino-dépendant, maladie auto-immune détruisant les ilots de Langerhan,s qui normalement fabriquent cette hormone hypoglycémiante).

RT-PCR.jpg

page 15 à 19 : Pas de découragement les jeunes ! on a tous les outils : après c'est trop easy ! on sait déjà tout, on va s'enfiler 4 pages en un clin d'oeil, vous verrez !

 

IV-Clonage de l'ADN

 

*p15-colorier le schéma de la page 15 "les étapes du clonage d'un gène" en suivant les instruction habituelles :

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-à gauche du schéma colorier en rouge les 3 longs chromosomes (Le second possède en pointillés le gène de l'hormone de croissance humaine, celui qu'on veut cloner ! vous avez repéré !)

- les fragments de restriction d'ADN génomique (dont toujours notre fameux gène de l'hormone de croissance humaine en pointillé , le gène TPI est dans les fragments sans interet en trait plein)

 

-à droite du schéma colorier en vert les ARNm récupérés par chromato d'affinité sur colonne de polyU, puis en rouge les ADNc obtenus après RT-PCR

 

-étape 3 de recombinaison:

-laisser le plasmide circulaire en noir (il s'est refermé sur lui même en c)

-y insérer le  gène de l'hormone de croissance ou l'ADNc de l'hormone de croissance en pointillé rouge (a)

-ou un gène ou ADNc rouge sans interet (TPI) (b)

 

-étape 4 de transfection

-colorier de la meme facon les plamides ayant tranfecté les 4 bactéries a, b, c et d

​

*p16 : RT-PCR = c'est fait

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*p17 : PCR = c'est maîtrisé depuis 1 semaine (les doigts dans le nez que j'vous disais!)

​

*p 18 :

C-divers vecteurs où insérer les gènes d'intérêt

-les plasmides

-l'ADN de virus bactériens (=bactériophages = phages)

​

D-diverses techniques de transfection existent

-transformation : l'ADN recombinant est incubé dans le milieu avec les bactéries à transfecter et eentre dans la bactéries par des porines;

-transduction l'ADN recombinant est incubé avec une protéine de capside virale qui se polymérise spontanément en s'enrourant autour (on parle d'encapsidation de l'ADN). Cela forme (protéine de capside + ADN) un bactériophage recombinant qui a plus d'efficacité pour transfecter la bactéries.

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*p19 :

E-identification des cellules transfectées avec le vecteur recombinant grâce aux gènes rapporteurs

-2ème exemple en bas de page (vecteur pUc) classique avec un site de restriction dans le gène de la béta-gal (déjà fait youpi !, on maîtrise)

-1er exemple : idem mais au lieu du gène béta-gal, on utilise un second gène de résistance aux amtibiotiques comme gène rapporteur de l'étape de recombinaison. Dans notre exemple le gène TetR conférant une Résistance à la tétracycline.

           colorier l'insert à petits points en rouge

           en haut à droite remplir les 3 phénotypes des bactéries : dans l'ordre :

                          [AmpR, TetS] => Celles qu'on désire garder et cloner car elles ont l'insert d'interet.

                          [AmpR, TetR] => ne servent à rien car le plasmide s'est refermé sur lui-même sans rien insérer.

                          [AmpS, TetS] => bactéries non transfectées qui vont mourir de toutes façon sur milieu contenant de l'Ampicilline.

Problème : Comment faire pour garder les bactéries [AmpR, TetR] d'interet ?

-Si on fait pousser sur milieu Amp, on garde les deux premier phénotypes, si on rajoute de la Tétracycline les bactéries qui nous interessent vont mourir (et cellules dont on se fiche vont pousser...

-Il faut faire une réplique des clones qui on poussé sur milieu Amp pour voir s'ils meuvent sur milieu Tet grâce à un tampon de velours (tissu qui a plein de petites fibres verticales permettant de prélever quelques bactéries d'un clone et de les déposer selon la même organisation dans l'espace du milieu Tet).

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Je parlerai de Crispr-Cas 9 jeudi et non aujourd'hui

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Ophrys Marie.JPG

cliquer ici pour retourner à la page de cours chapitre 4

   Jeudi

26 mars

   2020

​Au programme de ce jeudi 26 mars:

 

TP4 : Changement de plan : on se le finit !!! (pour la page 13 : Puces à ADN, on regarde le diaporama de MALB FIN mais  on le reverra la semaine prochaine ).

 

III-Hybridation des acides nucléiques (p11 à 14)

+ I-C-Crispr-Cas9 (avant la page 9 du poly)

III-Hybridation des acides nucléiques (p11 à 14)

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Poly TP4 p11

L'objet de cette partie est d'étudier les techniques de détection de séquences d'AN (détection de gènes ou d'ARN) basées sur l'hybridation avec un acide nucléique monobrin complémentaire et visible (donc marqué) qu'on nomme sonde moléculaire.

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L'hybridation peut se réaliser : -In situ dans une cellule (dont la membrane a été auparavant "perméabilisée" pour que la sonde puisse entrer)

                                                     -sur un gel d'électrophorèse (en vérité une membrane de nitrocellulose sur laquelle on a fait un blotting du gel)

                                                    -sur des lames de verre nommées " puces à ADN" que nous verrons la semaine prochaine.

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Elle nécessite 3 étapes :

1-construction de la sonde qui est monobrin (pour pouvoir s'hybrider!), de séquence choisie (complémentaire de la séquence recherchée), marquée (donc visible)

2-hybridation de la sonde avec l'AN recherché (si on recherche un ARN, pas de pb car il est monobrin, si on recherche un gène, il est nécessaire de'ouvrir l'hélice auparavant)

3-révélation de la sonde (après une étape de lavage  qui évacue les sondes non hybridées évidemment) par autoradiographie ou détection de fluorescence.

hybridation.jpg

A-Hybridation sur gel : Southern blot (si on détecte des molecules d'ADN) et Northern Blot (si on détecte des ARN)

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Nous avons vu au début de l'année...

-le Western Blot qui permet, après séparation des protéines selon leur masse (SDS-PAGE) par électrophorèse, de détecter une protéine grâce à un Ac marqué.

 

Aujourd'hui nous allons voir...

-le Southern Blot qui permet, après séparation de molécules d'ADN selon leur taille par électrophorèse, de détecter un gène grâce à une sonde AN marquée.

-le Northern Blot qui permet, après séparation de molécules d'ARN par electrophorèse, de détecter un ARNm grâce à une sonde d'AN marquée.

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Nous avons au début de l'année, que les Ac ne pouvaient entrer dans le gel pour diffuser jusqu'à la protéine recherchée, et qu'il était nécessaire, lors d'un Western blot de faire "sortir" les protéines du gel par une étape de blotting sur une membrane de nitrocellulose.

Réaliser un blot de l'electrophorèse est aussi indispensable pour hybrider les sondes aux AN : on réalise donc aussi un transfert sur membrane.

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Pourquoi ces noms bizzarres ? La première technique mise au point permettait de détecter des gènes, elle a été mise au point par monsieur Southern, on l'a donc nommée Southern Blot, du nom de son inventeur. La technique a éte ensuite utilisée pour rechercher des ARN puis légèrement modifiée pour les protéines, et comme les biologistes sont des petits farceurs (!), ils ont utilisé les points cardinaux pour nommer les autres techniques.

-Lire et comprendre la technique page 11

-Faire l'exercice d'application page 14 (exercice de recherche de paternité -> correction stylo marron)

B-Hybridation in situ

Sur  chromosomes, sur organisme, sur cultures de cellules

-Lire p12

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C-Hybridation sur puces à ADN

-Regarder le diaporama de MALB TP4 séance 3 FIN (ci-dessous) : on reverra la technique la semaine prochaine dans le cours (pas d'inquiétude si vous ne comprenez pas cette première fois, mais Marie-Aude a fait le diaporama donc profitons-en !)

 

D-KO de gènes par stratégie antisens

-Lire p 14 et comprendre que si un ARN antisens (issu de la transcription d'un gène artificiel inséré dans le génome) est présent dans le cytoplasme en même temps que l'ARNm sens (normal), il peut s'hybrider avec en duplex ARNm/ARNantisens, ce qui empêche la traduction de l'ARNm par les ribosomes.

La stratégie antisens bloque donc la traduction d'un ARNm en protéine.

+ I-C-Crispr-Cas9 et l'éditing du génome : comment utiliser le génome comme un traitement de texte (couper/coller.copier) ?

 

-on retourne à la fin du I  (avant la page 9 du poly) pour parler d'une endonucléase nommée Cas9 qui coupe l'ADN si son petit ARN guide coenzyme (crispr) trouve sa séquence d'ADN complémentaire.

L'outil Crispr-Cas9 est un ciseau à ADN qui découpe les séquences que lui indique l'ARN guide crisper.

Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna ont modifié cette enzyme (naturellement présente chez les bactéries pour dégrader les ADN) pour servir d'éditeur de génome.

L'idée est que les chercheurs construisent artificiellement un ARN guide (par exemple CUCUCUCU), et la Cas9  découpera les séquences d'ADN complémentaires (GAGAGAGA).

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Lire la page Crispr du poly et visionner les films ci dessous.

Dans l'ordre des videos :              1-la technique crispr-Cas9;                   2-les pb éthiques;                  3-Lulu et Nana, les premiers humains génétiquement modifiés

Ophrys Marie.JPG

cliquer ici pour retourner à la page de cours du chapitre 4

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